jofinЖурнал инфектологииJournal Infectology2072-6732IPO “АIDSSPbR"10.22625/2072-6732-2020-12-3-42-50jofin-1077Research ArticleОригинальное исследованиеOriginal ResearchАнтигенные свойства изолята коронавируса SARS-CoV-2/human/RUS/Nsk-FRCFTM-1/202, выделенного от пациента в НовосибирскеAntigenic properties of sARs-CoV-2/human/RUs/nsk-FRCFtM-1/2020 coronavirus isolate from a patient in novosibirskЧепурновА. А.ChepurnovA. A.

Чепурнов Александр Алексеевич – ведущий научный сотрудник отдела экспериментального моделирования и патогенеза инфекционных заболеваний, д.б.н., профессор 

Новосибирск; тел.: 8(383)335-94-05

Novosibirsk

alexa.che.purnov@gmail.comШаршовК. А.SharshovK. A.

Шаршов Кирилл Александрович – заведующий лабораторией моделирования и мониторинга инфекционных процессов, к.б.н.

Novosibirsk

sharshov@yandex.ruКазачинскаяЕ. И.KazachinskayaE. I.

Казачинская Елена Ивановна – ведущий научный сотрудник отдела экспериментального моделирования и патогенеза инфекционных заболеваний, д.б.н.

Новосибирск; тел.: 8(383)335-94-05

Novosibirsk

lena.kazachinskaia@mail.ruКононоваЮ. В.KononovaYu. V.

Кононова Юлия Владимировна – старший научный сотрудник отдела экспериментального моделирования и патогенеза инфекционных заболеваний, к.б.н. 

Novosibirsk

yuliakononova07@yandex.ruКазачковаЕ. А.KazachkovaE. A.

 

Novosibirsk

evgesha_c@mail.ruХрипкоО. П.KhripkoO. P.

Хрипко Ольга Павловна – старший научный сотрудник отдела экспериментального моделирования и патогенеза инфекционных заболеваний, к.б.н. 

Новосибирск; тел.: 8(383)335-94-05

Novosibirsk

khripkoolga@gmail.comЮрченкоК. С.YurchenkoK. S.

Юрченко Ксения Сергеевна – старший научный сотрудник лаборатории моделирования и мониторинга инфекционных процессов, к.б.н.

Novosibirsk

xenia7yurchenko@gmail.comАлексеевА. Ю.AlekseevA. Yu.

Алексеев Александр Юрьевич – заведующий лабораторией разработки и испытания фармакологических средств, к.б.н.

Novosibirsk

al-alexok@ngs.ruВоеводаМ. И.VoevodaM. I.

Воевода Михаил Иванович – Врио директора, д.м.н., профессор, академик РАН 

Novosibirsk

director@centercem.ruШестопаловА. М.ShestopalovA. M.

Шестопалов Александр Михайлович – заведующий отделом экспериментального моделирования и патогенеза инфекционных заболеваний, д.б.н., профессор

Novosibirsk

shestopalov2@mail.ruФедеральный исследовательский центр фундаментальной и трансляционной медицины Сибирского отделения РАНРоссияFederal Research Center of Fundamental and Translational Medicine, Siberian Branch of Russian Academy of SciencesRussian Federation2020010820201234250Copyright © Чепурнов А.А., Шаршов К.А., Казачинская Е.И., Кононова Ю.В., Казачкова Е.А., Хрипко О.П., Юрченко К.С., Алексеев А.Ю., Воевода М.И., Шестопалов А.М., 20202020Чепурнов А.А., Шаршов К.А., Казачинская Е.И., Кононова Ю.В., Казачкова Е.А., Хрипко О.П., Юрченко К.С., Алексеев А.Ю., Воевода М.И., Шестопалов А.М.Chepurnov A.A., Sharshov K.A., Kazachinskaya E.I., Kononova Y.V., Kazachkova E.A., Khripko O.P., Yurchenko K.S., Alekseev A.Y., Voevoda M.I., Shestopalov A.M.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://journal.niidi.ru/jofin/article/view/1077

Цель: изоляция коронавируса SARS-CoV-2 из образцов носоглоточных мазков, положительных на наличие РНК SARS-CoV-2, получение инактивированного цельновирионного антигена и изучение его антигенных свойств. Материалы и методы: изоляцию вируса проводили на культуре клеток Vero из вируссодержащего образца клинического материала (мазок из носоглотки). Эффективность репликации вируса SARS-CoV-2 на культуре клеток оценивали по динамике появления цитопатического действия и наличию вирусной РНК при анализе культуральной жидкости методом обратной транскрипции – полимеразной цепной реакции. Очистку, концентрацию и инактивацию вирусного препарата проводили по стандартной методике. Степень чистоты очищенного препарата и профиль вирусных белков определяли методом электрофореза в 10% полиакриламидном геле с добавлением додецилсульфата натрия. Наличие и специфичность вирусных белков выявляли с помощью сывороток крови реконвалесцентов с диагнозом «COVID-19» методами иммуноферментного анализа и иммуноблоттинга. Результаты: из вируссодержащего клинического образца был выделен изолят SARS-CoV-2/human/RUS/ Nsk-FRCFTM-1/2020 и получен очищенный, концентрированный, инактивированный цельновирионный антиген, содержащий три структурных белка – гликопротеин S (примерно 200 кДа), нуклеопротеин N (48 кДа) и матриксный М (20-25 кДа), выявляемые антителами сывороток крови реконвалесцентов с диагнозом COVID-19. Заключение: показана возможность изоляции коронавируса SARS-CoV-2 на культуре клеток Vero. В очищенном вирусном препарате, инактивированном в лизирующем растворе, сохраняется антигенная специфичность трех структурных вирусных белков (S, N, и М), выявляемых антителами сывороток крови реконвалесцентов с диагнозом COVID-19. Инактивированный цельновирионный антиген изолята SARS-CoV-2/human/ RUS/Nsk-FRCFTM-1/2020 может быть использован для изучения антигенных иммуномодулирующих свойств вирусных белков, получения иммунных сывороток лабораторных животных, а также в качестве компонента тест-систем для выявления специфичных антител методом ИФА и иммуноблоттинга.

Objective: isolation of coronavirus SARS-CoV-2 from clinical sample of patient with COVID-19 in Novosibirsk; obtaining a purified and inactivated viral antigen and study of its antigenic properties. Materials and methods: virus isolation was carried out in Vero cell culture from nasopharyngeal swab positive on SARS-CoV-2 RNA. The efficiency of SARSCoV-2 replication in cell culture was assessed on the appearance of cytopathic effect (CPE) and the presence of viral RNA in cultural medium with reverse transcription – polymerase chain reaction (RT-PCR). Purification, concentration and inactivation of the viral preparation were carried out according to standard methods. The purity of the purified preparation and the profile of viral proteins were determined by electrophoresis in 10% polyacrylamide gel (PAG) with the addition of sodium dodecyl sulfate (SDS). The presence and specificity of viral proteins were detected using COVID-19 convalescent’s sera with enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and immunoblotting. Results: SARS-CoV-2/human/ RUS/Nsk-FRCFTM-1/2020 isolate was obtained after passage on Vero cells from a virus-containing clinical sample. A purified, concentrated, inactivated, whole-virion antigen was obtained. It contains three structural proteins: glycoprotein S (approximately 200 kDa), nucleoprotein N (48 kDa), and matrix protein M (20-25 kDa). All viral proteins were detected with serum antibodies of COVID-19 convalescents. Conclusion: SARS-CoV-2 coronavirus can be isolated in Vero cell culture. The antigenic specificity of the three structural viral proteins (S, N, and M) is preserved in the purified inactivated viral preparation. The inactivated whole-virion antigen of SARS-CoV-2/human/RUS/Nsk-FRCFTM-1/2020 isolate can be used to study the antigenic immunomodulating properties of viral proteins, to obtain immune sera of laboratory animals, and also as a component of test systems for the detection of specific antibodies with ELISA and immunoblotting.

коронавирус тяжелого острого респираторного синдрома 2 типа (SARS-CoV-2)коронавирусная инфекция 2019 (COVID-19)культура клеток Veroвирусные белкиsevere acute respiratory syndrome type 2 coronavirus (SARS-CoV-2)coronavirus infection 2019 (COVID-19)Vero cell cultureviral proteinsReferencesVirus Taxonomy: 2019 Release. EC 51, Berlin, Germany, July 2019. [Электронный ресурс]. URL: https://talk.ictvonline.org/taxonomy/ (дата обращения 10.06.2020).Virus Taxonomy: 2019 Release. EC 51, Berlin, Germany, July 2019. International website [Internet]. Available from: https://talk.ictvonline.org/taxonomy/ (10.06.2020).Masters, P.S. The molecular biology of coronaviruses / P.S. Masters // Adv. Virus. Res. – 2006. – Vol. 66. – P. 193- 292. – doi: 10.1016/S0065-3527(06)66005-3.Masters, P.S. The molecular biology of coronaviruses / P.S. Masters // Adv. Virus. Res. – 2006. – Vol. 66. – P. 193- 292. – doi: 10.1016/S0065-3527(06)66005-3.Accessory proteins of SARS-CoV and other coronaviruses / D.X. Liu, T.S. Fung, K.K. Chong, et al. // Antiviral Res. – 2014. – Vol. 109. – P. 97-109. – doi: 10.1016/j.antiviral.2014.06.013.Accessory proteins of SARS-CoV and other coronaviruses / D.X. Liu, T.S. Fung, K.K. Chong, et al. // Antiviral Res. – 2014. – Vol. 109. – P. 97-109. – doi: 10.1016/j.antiviral.2014.06.013.The origin, transmission and clinical therapies on coronavirus disease 2019 (COVID-19) outbreak – an update on the status / Y.R. Guo, Q.D. Cao, Z.S. Hong, et al. // Mil. Med. Res. – 2020. – Vol. 7. – N. 1. – P. 11. – doi: 10.1186/s40779-020-00240-0.The origin, transmission and clinical therapies on coronavirus disease 2019 (COVID-19) outbreak – an update on the status / Y.R. Guo, Q.D. Cao, Z.S. Hong, et al. // Mil. Med. Res. – 2020. – Vol. 7. – N. 1. – P. 11. – doi: 10.1186/s40779-020-00240-0.Вступительное слово Генерального директора ВОЗ на брифинге по COVID-19 для постоянных представительств – 12 марта 2020 г. [Электронный ресурс]. URL: https://www.who.int/ru/dg/speeches/detail/who-directorgeneral-s-opening-remarks-at-the-mission-briefing-on-covid-19---12-march-2020 (дата обращения 19.06.2020).WHO Director-General’s opening remarks at the Mission briefing on COVID-19 – 12 March 2020. International website [Internet]. URL: https://www.who.int/ru/dg/speeches/detail/who-director-general-s-opening-remarks-at-the-mission-briefing-on-covid-19---12-march-2020 (available 19.06.2020).Virus Isolation from the First Patient with SARS-CoV-2 in Korea / W.B. Park, N.J. Kwon, S.J. Choi, et al. // J. Korean Med. Sci. – 2020 – Vol. 35. – N. 7. – e84. – doi: 10.3346/jkms.2020.35.e84.Virus Isolation from the First Patient with SARS-CoV-2 in Korea / W.B. Park, N.J. Kwon, S.J. Choi, et al. // J. Korean Med. Sci. – 2020 – Vol. 35. – N. 7. – e84. – doi: 10.3346/jkms.2020.35.e84.Получение очищенного вируса Эбола / А.А. Чепурнов [и др.] // Вопросы вирусологии. – 1994. – Т. 39, № 6. – С. 254–257.Isolation of purified Ebola virus / A.A. Chepurnov, N.V. Merzlikin, E.I. Ryabchikova et al. // Vopr. Virusol. – 1994. – Vol. 39. – N. 6. – P. 254-257. [in Russian]Разумов, И.А. Антигенные отличия дикого и адаптированного к морским свинкам штаммов вируса Эбола / И.А. Разумов, Е.И. Казачинская, А.А. Чепурнов // Вопросы вирусологии. – 2010. – Т. 55. – №. 6. – С. 35-38.Razumov I.A. Antigenic differences in wild-type and guinea pig-adapted Ebola virus strains / I.A. Razumov, E.I. Kazachinskaia, A.A. Chepurnov // Vopr. Virusol. – 2010. – Vol. 55. – N. 6. – P. 35-38. [in Russian]Взаимодействие фрагментов оболочечного белка вируса Зика с антителами сывороток людей, переболевших флавивирусными инфекциями / Д.В. Шаньшин [и др.] // Инфекция и иммунитет. – 2020. – Т. 10, № 1. – С. 73– 82. – doi: 10.15789/2220-7619-AIO-805.An interaction of Zika virus envelope fragments with serum antibodies derived from subjects after flavivirus infections / D.V. Shanshin, A.Yu. Bakulina, E.I. Kazachinskaia et al. // Russian Journal of Infection and Immunity = Infektsiya i immunitet – 2020. – Vol. 10. – N. 1. – P. 73–82. – doi: 10.15789/2220-7619-AIO-805. [in Russian]Казачинская, Е.И. Штамм гибридных клеток животного Mus musculus L. 5Н6 – продуцент моноклональных антител для выявления гликопротеина Е вируса Западного Нила; моноклональные антитела 5Н6, продуцируемые указанным штаммом гибридных клеток и иммуноферментный набор для выявления гликопротеина вируса Западного Нила с использованием указанных моноклональных антител / Е.И. Казачинская, И.А. Разумов, В.Б. Локтев // Патент на изобретение RU 2595429 C1, 27.08.2016. Заявка № 2015115059/10 от 21.04.2015.Kazachinskaia, E.I. Strain of hybrid animal cells Mus musculus L. 5H6 – producer of monoclonal antibodies for detecting glycoprotein E of West Nile virus, 5H6 monoclonal antibodies produced by said strain of hybrid cells, and immunoenzymometric kit for detecting glycoprotein E of West Nile virus using said monoclonal antibodies / E.I. Kazachinskaia, I.A. Razumov, V.B. Loktev // Patent RU 2595429 C1, 27.08.2016. Application № 2015115059/10 at 21.04.2015. [in Russian]Sturman L.S. I. Structural Proteins: Effects of Preparative Conditions on the Migration of Protein in Polyacrylamide Gels. / L.S. Sturman. // J. Virol. – 1977. – Vol. 77. – N. 2. – P. 637- 649. – doi: 10.1016/0042-6822(77)90488-3.Sturman L.S. I. Structural Proteins: Effects of Preparative Conditions on the Migration of Protein in Polyacrylamide Gels. / L.S. Sturman. // J. Virol. – 1977. – Vol. 77. – N. 2. – P. 637- 649. – doi: 10.1016/0042-6822(77)90488-3.Dea S. Identification and Location of the Structural Glycoproteins of a Tissue Culture-Adapted Turkey Enteric Coronavirus. / S. Dea, S. Garzon, P. Tijssen // Arch Virol. – 1989. – Vol. 106. –N. 3-4. – P. 221-237. doi: 10.1007/BF01313955.Dea S. Identification and Location of the Structural Glycoproteins of a Tissue Culture-Adapted Turkey Enteric Coronavirus. / S. Dea, S. Garzon, P. Tijssen // Arch Virol. – 1989. – Vol. 106. –N. 3-4. – P. 221-237. doi: 10.1007/BF01313955.A complete sequence and comparative analysis of a SARS-associated virus (Isolate BJ01) / E.D. Qin, Q.Y. Zhu, M. Yu, et al. // Chin. Sci. Bull. – 2003. – N. 48. – P. 941-948. doi: 10.1007/BF03184203.A complete sequence and comparative analysis of a SARS-associated virus (Isolate BJ01) / E.D. Qin, Q.Y. Zhu, M. Yu, et al. // Chin. Sci. Bull. – 2003. – N. 48. – P. 941-948. doi: 10.1007/BF03184203.Rapid Development of an Inactivated Vaccine Candidate for SARS-CoV-19 / Q. Gao, L. Bao, M. Haiyan, et al. // Science. – 2020. – eabc1932. – doi: 10.1126/science.abc1932Rapid Development of an Inactivated Vaccine Candidate for SARS-CoV-19 / Q. Gao, L. Bao, M. Haiyan, et al. // Science. – 2020. – eabc1932. – doi: 10.1126/science.abc1932Kuo L. Analyses of Coronavirus Assembly Interactions With Interspecies Membrane and Nucleocapsid Protein Chimeras. / L. Kuo, K.R. Hurst-Hess, C.A. Koetzner, et al. // J. Virol. – 2016. – Vol. 90. – N. 9. – P. 4357-4368. – doi: 10.1128/JVI.03212-15.Kuo L. Analyses of Coronavirus Assembly Interactions With Interspecies Membrane and Nucleocapsid Protein Chimeras. / L. Kuo, K.R. Hurst-Hess, C.A. Koetzner, et al. // J. Virol. – 2016. – Vol. 90. – N. 9. – P. 4357-4368. – doi: 10.1128/JVI.03212-15.Liu X. Profile of Antibodies to the Nucleocapsid Protein of the Severe Acute Respiratory Syndrome (SARS)-associated Coronavirus in Probable SARS Patients. / X. Liu, Y. Shi, P. Li, et al. // Clin. Diagn. Lab. Immunol. – 2004. – Vol. 11. – N. 1. – P. 227-228. – doi: 10.1128/cdli.11.1.227-228.2004.Liu X. Profile of Antibodies to the Nucleocapsid Protein of the Severe Acute Respiratory Syndrome (SARS)-associated Coronavirus in Probable SARS Patients. / X. Liu, Y. Shi, P. Li, et al. // Clin. Diagn. Lab. Immunol. – 2004. – Vol. 11. – N. 1. – P. 227-228. – doi: 10.1128/cdli.11.1.227-228.2004.van der Hoek L. Human coronaviruses: what do they cause? / L. van der Hoek // Antivir. Ther. – 2007. – Vol. 12. – N. 4. – Pt. B. – P. 651-658.van der Hoek L. Human coronaviruses: what do they cause? / L. van der Hoek // Antivir. Ther. – 2007. – Vol. 12. – N. 4. – Pt. B. – P. 651-658.SARS and MERS: recent insights into emerging coronaviruses / E. de Wit, N. van Doremalen, D. Falzarano, et al. // Nat. Rev. Microbiol. – 2016. – Vol. 14. – N. 8. P. 523-534. – doi: 10.1038/nrmicro.2016.81.SARS and MERS: recent insights into emerging coronaviruses / E. de Wit, N. van Doremalen, D. Falzarano, et al. // Nat. Rev. Microbiol. – 2016. – Vol. 14. – N. 8. P. 523-534. – doi: 10.1038/nrmicro.2016.81.SARS-CoV-2 Cell Entry Depends on ACE2 and TMPRSS2 and Is Blocked by a Clinically Proven Protease Inhibitor / M. Hoffmann, H. Kleine-Weber, S. Schroeder, et al. // Cell. – 2020. – Vol. 181. – N. 2. – P. 271-280. – e8. – doi: 10.1016/j.cell.2020.02.052.SARS-CoV-2 Cell Entry Depends on ACE2 and TMPRSS2 and Is Blocked by a Clinically Proven Protease Inhibitor / M. Hoffmann, H. Kleine-Weber, S. Schroeder, et al. // Cell. – 2020. – Vol. 181. – N. 2. – P. 271-280. – e8. – doi: 10.1016/j.cell.2020.02.052.Use of viral lysate antigen combined with recombinant protein in Western immunoblot assay as confirmatory test for serodiagnosis of severe acute respiratory syndrome / M. Guan, H.Y. Chen, P.H. Tan, et al. // Clin. Diagn. Lab. Immunol. – 2004 – Vol. 11. – N. 6. P. 1148–1153. – doi: 10.1128/CDLI.11.6.1148-1153.2004.Use of viral lysate antigen combined with recombinant protein in Western immunoblot assay as confirmatory test for serodiagnosis of severe acute respiratory syndrome / M. Guan, H.Y. Chen, P.H. Tan, et al. // Clin. Diagn. Lab. Immunol. – 2004 – Vol. 11. – N. 6. P. 1148–1153. – doi: 10.1128/ CDLI.11.6.1148-1153.2004.Antibody responses to individual proteins of SARS coronavirus and their neutralization activities / M. Qiu, Y. Shi, Z. Guo, et al. // Microbes Infect./Institut Pasteur. – 2005. – Vol. 7. – N. (5-6). – P. 882-889. – doi: 10.1016/j.micinf.2005.02.006.Antibody responses to individual proteins of SARS coronavirus and their neutralization activities / M. Qiu, Y. Shi, Z. Guo, et al. // Microbes Infect./Institut Pasteur. – 2005. – Vol. 7. – N. (5-6). – P. 882-889. – doi: 10.1016/j.micinf.2005.02.006.Temporal profiles of viral load in posterior oropharyngeal saliva samples and serum antibody responses during infection by SARS-CoV-2: an observational cohort study / K.K. To, O.T. Tsang, W.S. Leung, et al. // Lancet Infect. Dis. – 2020. – Vol. 20. – N. 5. – P. 565-574. – doi: 10.1016/S1473-3099(20)30196-1.Temporal profiles of viral load in posterior oropharyngeal saliva samples and serum antibody responses during infection by SARS-CoV-2: an observational cohort study / K.K. To, O.T. Tsang, W.S. Leung, et al. // Lancet Infect. Dis. – 2020. – Vol. 20. – N. 5. – P. 565-574. – doi: 10.1016/S1473-3099(20)30196-1.Profile of IgG and IgM antibodies against severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) / J. Qu, C. Wu, X. Li, et al. // Clin. Infect. Dis. – 2020. – ciaa489. – doi: 10.1093/cid/ciaa489.Profile of IgG and IgM antibodies against severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) / J. Qu, C. Wu, X. Li, et al. // Clin. Infect. Dis. – 2020. – ciaa489. – doi: 10.1093/cid/ciaa489.Serological responses in patients with severe acute respiratory syndrome coronavirus infection and cross-reactivity with human coronaviruses 229E, OC43, and NL63. / K.H. Chan, V.C. Cheng, P.C. Woo, et al. // Clin. Diagn. Lab. Immunol. – 2005. Vol. 12. – N. 11. – P. 1317-1321. – doi: 10.1128/CDLI.12.11.1317-1321.2005.Serological responses in patients with severe acute respiratory syndrome coronavirus infection and cross-reactivity with human coronaviruses 229E, OC43, and NL63. / K.H. Chan, V.C. Cheng, P.C. Woo, et al. // Clin. Diagn. Lab. Immunol. – 2005. Vol. 12. – N. 11. – P. 1317-1321. – doi: 10.1128/CDLI.12.11.1317-1321.2005.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.